Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området

Transkript

1 Elektron-absorbtionspektroskopi för biomolekyler i UV-VIS-området Principer Koncentrationsmätning Detektion Kromoforer, kolorimetriska assays DNA Komparativ analys Jonbindning

2 Spektroskopisk analys av biomolekyler Begränsningar: Vad finns i molekylen som kan interagera med ljus? Hur påverkas mätningen av lösningsmedlet?

3 Intensiteten hos ljusabsorbansen vid en energiövergång beror på hur bra ljuset kan växelverka med de elektriska dipolerna i systemet för just den övergången Aceton analog till peptid C=O

4 Dimetylamid analog till peptid NH

5 Hur borde peptidbindningens absorbans se ut?

6 Peptidgruppens absorbans π π* ε max 7000 n π* ε max 100

7 Peptidgruppens absorbans

8 Övergångar mindre distinkta i lösning pga olika typer av störningar Figur 9.2 I vattenlösning: H 2 O absorberar under 170 nm Polariteten breddar absorbtionsbanden Salthalt 0.15 M NaCl, ph ~7 är fysiologiskt Temperatur o C

9 Hur ligger övergångsdipolmomentet? Kvävets deltagande i π och π*-orbitalerna gör att övergångsdipolmomentet inte ligger helt längs dubbelbindningen hela peptidbindningens egenskaper påverkar absorbansen för π - π*- övergången.

10 Samverkan mellan övergångsdipolmoment Övergångsdipolmomenten kan interagera om de ligger ordnat beror av relativ orientering och avstånd. Detta förklarar varför sekundärstruktur påverkar absorbansen!

11 För proteiner: störst absorbans i regionen nm

12 Vad absorberar mer i UV hos ett protein? Trp Tyr Phe Flera aminosyrors sidokedjor absorberar < 230 nm, t ex Asp, Glu, Asn, Gln, Arg, His, men med mycket mindre ε vilket gör detektionen svår.

13 Empiriskt: Beer-Lamberts lag Andelen absorberat ljus är proportionell mot antalet absorberande molekyler -di/i = C ε dl Integrera: Med 10 som bas: ln (I 0 /I) = C ε l A (λ) = C ε (λ) l Maximal absorbtion: ε = 10 5 M -1 cm -1 (härledning i kompendiet) För en stark absorbent: ε = 10 4 M -1 cm -1 dvs 10% av allt ljus absorberas

14 Koncentrationsmätning A (λ) = ε (λ) l c Bestämning av ε : vid 280 nm beror detta främst av antalet Trp, Tyr, Phe OBS: strukturberoende! ph-beroende! HUR GÖRA?

15 Teoretisk uppskattning av extinktionskoefficienter Det är möjligt att få en god uppskattning av den molära extinktionskoefficienten från aminosyrasammansättningen vidph 6.5, 6.0 M guanidium hydrochlorid, 0.02 M fosfatbuffer, och våglängder >260 nm om proteinet innehåller tyrosin, tryptofan och/eller cystine (S-S) (cystein absorberar dåligt >260 nm) Följande ekvation används: ε(prot) = #(Tyr)* ε(tyr) + #(Trp)* ε(trp) + #(Cys)* ε(cys) Gill S.C., von Hippel P.H. "Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data." Anal. Biochem. 182: (1989).

16 MPVSASLACK NYDYDYDSIQ PYFYFDNDDFYHHQQGQT QPSAPSEDIW KKFELLPTPP LSPSRRQSLS TAEQLEMVSE FLGDDVVSQS FICDDADYSQ SFIKSIIIQD CMWSGFSAAA Number of amino acids: 120 Molecular weight: Theoretical pi: 4.01 Extinction coefficients: Extinction coefficients are in units of M -1 cm -1, at 280 nm. Ext. coefficient Abs 0.1% (=1 g/l) 1.575, assuming ALL Cys residues appear as half cystines Ext. coefficient Abs 0.1% (=1 g/l) 1.565, assuming NO Cys residues appear as half cystines Om utan W (2 st): Ext. coefficient Om utan W,Y (7 st): Ext. coefficient 1615 : 8 F inte tillräckligt!

17 Procedur för experimentell bestämning av extinktionskoefficienten: Fördelar / Nackdelar!

18 Kromoforer prostetiska grupper

19 ε*10-4 för Trp: 0.5 / 280nm; Tyr: 0.1 / 280nm; Phe:0.01 / 260nm

20 Kromoforer kan utnyttjas för att bestämma koncentrationen av biomolekyler - Specifik bindning till vissa strukturer / aminosyror - Mindre specifik bindning: massa, hydrofobicitet etc - ofta kolorimetrisk: ger en färg eller färgändring Kalibreringskurvor krävs! - Protein som liknar det analyserade

21 Tabell Differensspektrum : se kompendiet!

22 DNA: Nukleinsyrors absorbtion Varför varierar absorbansen med ph? Vid vilken våglängd är det klokt att analysera DNA-koncentration? Är det en känslig assay?

23 Konformationsberoende: duplex single strand Vilket är Enzymic digest och vilket är Native DNA?

24 Detektion upprening, isolering: känsligt! snabbt! tydligt! men kompletterande analys behövs oftast

25 Geldetektion

26 DNA detekteras i UV med interkalerad EtBr

27 Tillämpning: mätning av binding av cancerinhibitor till RNA

28 Komparativ analys: substansidentifiering

29 Jonbindning - zinkfingrar Med konkurrerande kromofor (i e BAPTA) Med Co 2+ istället för Zn 2+

30 Summering Ljus och dess interaktion med materia Absorbtionsspektroskopi i UV-området Introduktion till tillämpningar